论著讲座 - 欧正武名老中医传承工作室

您的位置: 欧正武名老中医传承工作室 论著讲座详细

九分散对胶原诱导性关节炎模型大鼠

发布时间:2014-06-11 23:17
分散来源于清代费山寿所著《急救应验良方》,
具有活血散瘀、消肿止痛、祛风通痹之功效,因内服剂
量每服九分(约3 g)故名。临床研究表明九分散治疗
痹证效果显著[1-4],实验研究亦显示九分散具有抗炎
镇痛疗效[5-7]。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,
RA)属于中医“痹证”范畴,是一种慢性、进行性、侵
袭性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎、破坏性关节病
变为主要特征,其致畸、致残率极高,遏制骨质破坏
是当前RA治疗的难点[8]。为进一步探讨九分散对类
风湿性关节炎的治疗效果,本实验以胶原诱导性关
节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠为模型,
观察九分散对CIA大鼠关节炎症及骨质破坏的影响。
* 基金项目:国家自然科学基金(81102564,81373551);湖南
省省属科研机构技术创新发展专项重点项目(2012TF1005);
湖南省教育厅基金(10C1035,60010408);湖南中医药大学中
医诊断学国家重点学科建设项目;湖南中医药大学细胞与分
子病理实验室建设项目;中西医结合临床湖南省省级重点学科;
湖南省科技厅项目:基于免疫调节机制的熊果酸抗类风湿关节
炎作用的研究
14
Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
第20卷
第1期
Vol.20
No. 1
2014 年 1 月
January.2014
1
材料与方法
1.1
药品和仪器
牛Ⅱ型胶原(Chondrex);弗氏不
完全佐剂(Sigma);地塞米松(吉林精优长白山药业
有限公司,规格:0.5 mL∶2.5 mg);九分散提取液(麻
黄、马钱子、乳香、没药各等份,原药购于湖南省消防
总队医院后自行制备);E-5299旋转蒸发仪(上海普
渡生化科技有限公司);Lecia Rm2135型石蜡切片机
(德国Lecia公司);光学显微镜(Nikon PHASE CON-
TRAST 0.90 DRY);照相机(Nikon Eclipse 80i);
Image-Pro Plus 5.0专业图像分析软件。
1.2
实验动物
SPF级健康Sprague-Dawley(SD)大
鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证
号:SCXK(湘)2011-0003),8周龄,雄性,体质量(112±
17)g,SPF级实验室正常饲养1周后实验。
1.3
方法
1.3.1
大鼠胶原诱导性关节炎动物模型的建立与评
估[9]
取50只雄性SD大鼠。随机选取8只作为正常对
照组(Normal),其余大鼠均复制CIA模型,将溶于醋
酸的牛Ⅱ型胶原(2 mg/mL)与弗氏不完全佐剂(IFA)
等体积混合,充分乳化,制成Ⅱ型胶原乳剂。大鼠用
10%的水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后,在无菌条件下,
于大鼠背部及尾根部多点注射(0.2 mL/只)配制好的
Ⅱ型胶原乳剂,以初次免疫当天作为0 d,第7 d按上
述方法、相同剂量加强1次。正常对照组按注射等体
积的生理盐水处理。用关节炎指数(AI)作为判断模
型是否成功的标准[10]。肢体关节肿胀按0-Ⅳ级评分:
0,无红肿;Ⅰ,趾关节稍肿;Ⅱ,趾关节及足趾关节肿
胀;Ⅲ,踝关节以下足爪肿胀;Ⅳ,包括踝关节在内的
全部足爪肿胀。AI值=四肢肢体关节肿胀等级评分之
和(Ⅰ级为1分,总分为16分)。AI≥4分为造模成功。
1.3.2
九分散制备
参考文献[7],用铁锅将干净的
细砂炒热,放入生马钱子干品适量(不去皮毛),翻炒
至褐色为度(宁过勿轻),取出放凉,用粉碎机打面过
100目筛,马钱子仁即成细面过至筛下,而皮毛则留
在筛上,备用;取乳香,没药适量分别用麸皮炒至油
尽,筛去麸皮;取麻黄、乳香、没药各等分混匀用粉碎
机打面过100目筛备用。取麻黄、乳香、没药药面适量
加入其1/3重量之马钱子粉(四味药按1∶1∶1∶1的比例)
共100 g,混匀,用80%乙醇加热回流提取两次,每次
加溶剂1000 mL,提取1 h。将两次提取液合并,过滤,
浓缩,水浴蒸干溶剂,即得乙醇提取物。给药前用水
配成混悬液,定容到100 mL(用少量吐温- 80助溶),
即1mL溶液相当于1 g原药材。
1.3.3
分组与给药
将造模成功的CIA大鼠随机分
为CIA模型组(CIA)、九分散低剂量组、九分散高剂
量组、地塞米松组(DXM),每组8只。在初次免疫后
16 d起,地塞米松组给予地塞米松1 mg/ (kg·3 d)腹
腔注射,九分散低剂量组给予九分散270 mg/ (kg·d)
灌胃,九分散高剂量组给予九分散 540 mg/ (kg·d)灌
胃,参考文献[11],九分散低剂量组的用量参照成人
口服剂量(生药3 g)进行大鼠等效剂量换算,九分散
高剂量组给予低剂量组2倍药量灌服。正常对照组和
CIA模型组大鼠分别给予等体积生理盐水灌胃,于
连续给药35 d后每只大鼠四肢行X线(XR/d型数字化
X线成像系统 KV:40-50 V;mA:100 Ma;S:32 ms)摄
片后处死动物,剪下踝关节进行研究。
1.3.4
观察指标
(1)大鼠体质量及关节炎指数测
定:初次免疫前称重1次,从致炎后7 d起,各组每隔
7 d,大鼠称重并按照“1.3.1”中以关节评分法评分
(0-4级),得出关节炎指数。(2)足肿胀度评价:自14 d
起,采用周长法测量大鼠左后肢足肿胀度[12]。致炎前
测量每个大鼠左足踝关节周长,从炎症出现后,每
7 d测量1次,观察足爪肿胀度(单位:mm)。(足爪肿
胀度=造模后踝关节周长-造模前周长)(3)关节X线
评分:连续给药35 d后,各组大鼠四肢关节置于X线
成像系统下摄片,观察关节与骨质破坏程度。参考文
献[10],将关节破坏分软组织肿胀、骨侵蚀和关节间
隙改变3个方面进行评价,将各组大鼠的关节破坏评
分进行统计:①软组织肿胀,0分:正常;1分:轻微的
肿胀;2分:中度肿胀;3分:严重肿胀。②骨侵蚀评分,
0分:正常;1分:可疑或1个微小局部病灶;2分:2个局
部病灶或病灶总表面积≤50%;3分:3个以上的病灶
总表面积>50%;4分:关节面完全破坏,或出现骨缩
小。③关节间隙,0分:正常;1分:间隙内出现可疑或
1个微小局部病灶;2分:关节间隙出现狭窄,比正常
关节间隙减少25%-50%;3分:关节强直或关节间隙
消失。每只大鼠评价两前足爪和继发侧后足爪,评分
最大值为9。(4)踝关节病理切片:处死动物后剪下双
后足炎性踝关节,福尔马林固定,10%EDTA脱钙液
中脱钙21 d,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,
切成5 μm切片,脱蜡,进行苏木精-伊红(HE)染色,
封片。光学显微镜下观察关节病理学改变,参考文献
[10],进行病理学评分,将各组大鼠的病理学评分进
行统计:踝关节病理评分为:①滑膜细胞增殖评分,
0:无增殖;1:轻微增殖,2-4层滑膜细胞;2:中度增
殖,4层以上滑膜细胞;3:滑膜细胞过度增殖,侵蚀软
15
第20卷
第1期
Vol.20
No.1
2014 年 1 月
January.2014
Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
骨和骨,关节间隙消失。②细胞侵蚀评分,0分:无侵
蚀;1分:较少的1至2个细胞侵蚀灶;2分:2至5个的局
部细胞侵蚀灶;3分:5个以上广泛细胞侵蚀到关节
囊。③血管翳评分,0分:无改变;1分:2个部位出现血
管翳;2分:4个部位出现血管翳,伴有软骨表面的侵
蚀;3分:4个以上部位出现血管翳或2个部位出现大
范围的血管翳。④炎症评分,0分:正常;1分:轻度
炎症,出现1个聚集物或少量散在炎性细胞(T细胞、
B细胞、巨噬细胞及浆细胞)浸润;3分:重度炎症,炎
细胞大量侵润,大量白细胞聚集,分散浸润明显。⑤
骨质侵蚀评分,0分:正常;1分:微量侵蚀,1-2个小的
浅部位;2分:少量侵蚀,1-4个中等大小和深度部位;
3分:中等侵蚀,5个以上部位,局部侵蚀到骨皮质;4
分:重度侵蚀,多重损伤,局部或完全侵蚀到骨皮
质;5分:广泛损伤,皮质穿透骨长度的25%以上。
1.4
统计学方法
采用SPSS 14.0统计软件进行统
计分析,计量资料以(x±s)表示,关节炎指数、肿胀度
采用双因素方差分析,X线和病理评分采用单因素
方差分析,多组间两两比较用q检验。P<0.01为差异
有统计学意义。
2


2.1
九分散对CIA大鼠体质量及关节指数(AI)的影

正常对照组大鼠生长良好,毛发光泽,体质量增
加。大鼠于造模后14 d左右逐渐出现多发性关节炎,
炎症指数升高,表现出四肢关节红肿、活动量减少、
食欲下降、毛发灰暗无泽和明显消瘦,双足关节红肿
逐日加重,21-28 d左右达到高峰。足跖明显增厚,
动作迟缓,爬行困难。28 d左右逐渐出现关节强直、
畸形以至功能障碍。各给药组大鼠关节炎症状较轻,
摄食积极,活跃,体质量均持续增加,皮毛光滑。与正
常对照组比较,CIA模型组各时间点AI明显增高,差
异有统计学意义(P<0.01);与CIA模型组相比,九分
散高、低剂量组和地塞米松组大鼠从21 d开始AI持
续降低,差异有统计学意义(P<0.01)。(见表1)
表1
九分散对CIA大鼠关节炎指数的影响
(x±s)
剂量
(mg/kg)
正常对照组 8
-
0
0
0
0
0
0
CIA模型组
8
-
4.2±0.3a12.5±3.1a13.6±2.8a11.2±3.1a10.1±2.3a8.7±2.1a
九分散低剂量组 8
270
4.2±0.6b7.9±1.5c
7.2±1.1c
5.1±0.9c
4.5±0.7c
3.1±0.5c
九分散高剂量组 8
540
4.4±0.4b6.1±1.3c
6.3±1.4c
4.4±0.5c
3.6±0.5c
2.4±0.4c
地塞米松组 8
1
4.4±0.6b5.9±1.2c
5.6±0.7c
4.0±0.3c
2.9±0.4c
1.9±0.3c
注:与正常对照组比较,aP<0.01;与CIA模型组比较,bP>
0.05,cP<0.01。
2.2
九分散对CIA大鼠足关节肿胀度的影响
与正
常对照组比较,其余各组CIA大鼠足爪肿胀度随着病
程延长逐渐升高,免疫后49 d,足爪肿胀依然明显。
与CIA模型组比较,各给药组大鼠足肿胀度明显减轻,
差异有统计学意义(P<0.01)。(见表2)
表2
九分散对CIA大鼠足肿胀度的影响
(x±s,mm)
剂量
(mg/kg)
正常对照组 8
-
1.1±0.1
1.2±0.1
1.2±0.2
1.3±0.2
1.6±0.2
2.1±0.3
CIA模型组
8
-
16.8±3.6a27.5±6.4a29.7±8.2a26.4±4.9a25.4±5.2a23.4±3.9a
九分散低剂量组 8
270 17.1±4.2b13.7±5.1c12.1±2.3c9.7±1.6c
9.2±1.5c
7.9±1.2c
九分散高剂量组 8
540 17.3±4.4b12.1±3.2c11.2±2.9c8.9±1.3c
8.5±1.33c6.6±1.1c
地塞米松组 8
1
16.9±3.7b9.7±2.4c
9.1±1.7c
8.5±1.6c
7.9±1.7c
5.9±1.4c
注:与正常对照组比较,aP<0.01;与CIA模型组比较,bP>
0.05,cP<0.01。
2.3
九分散对CIA大鼠关节X线片改变及评分的影

影像结果可见CIA模型组大鼠踝关节软组织肿
胀,骨质疏松、骨密度降低、骨侵蚀病灶明显可见,关
节间隙狭窄甚至消失(见图1)。各给药组大鼠关节X
线评分均较CIA模型组明显降低(P<0.01)。(见表3)
表3
九分散对CIA大鼠关节X线评分的影响
(x±s,分)
组别
只数
剂量(mg/kg)
X线评分
正常对照组
8
-
0.3±0
CIA模型组
8
-
7.1±1.3a
九分散低剂量组
8
270
3.8±0.7b
九分散高剂量组
8
540
2.5±0.5b
地塞米松组
8
1
2.2±0.6b
注:与正常对照组比较,aP<0.01;与CIA模型组比较,bP>
0.05,cP<0.01。
2.4
九分散对CIA大鼠关节病理改变及病理评分的
影响
正常对照组大鼠关节间隙正常,关节面光滑,
无明显炎性细胞浸润;CIA模型组大鼠关节滑膜增
生,向关节腔突出,大量炎性细胞浸润,血管翳形成,
软骨纤维化,关节骨组织破坏;各给药组光镜下病理
改变较CIA模型组明显减轻,滑膜有轻度增生,少量
炎性细胞浸润,关节间隙基本正常(见图2);各给药
组大鼠踝关节病理评分均较CIA模型组明显减少(P<
0.01)。(见表4)
表4
九分散对CIA大鼠关节切片病理评分的影响
(x±s,分)
组别
只数
剂量(mg/kg)
病理评分
正常对照组
8
-
1.8±0.3
CIA模型组
8
-
13.2±1.1a
九分散低剂量组
8
270
6.1±1.2b
九分散高剂量组
8
540
4.5±0.7b
地塞米松组
8
1
3.8±0.3b
注:与正常对照组比较,aP<0.01;与CIA模型组比较,bP>
0.05,cP<0.01。
组别
只数
14d
21d
28d
35d
42d
48d
组别
只数
14d
21d
28d
35d
42d
49d
16
Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
第20卷
第1期
Vol.20
No. 1
2014 年 1 月
January.2014
3


RA最终表现为不可逆的关节侵蚀和破坏。应用
Ⅱ型胶原蛋白混合弗氏不完全佐剂诱导的胶原诱导
性关节炎模型是研究人类RA的理想模型。该模型能
显示出RA的慢性病变特征如关节滑膜增生、软骨和
骨破坏,关节功能障碍。九分散具有活血散瘀、消肿
止痛、祛风通痹之功效,方中马钱子具有散结消肿,
通络止痛之功效,广泛配伍应用于临床。但该药有强
大毒性,且主要毒性成分为士的宁,研究发现马钱子
对关节炎的抑制作用的有效成分主要是马钱子总
碱,而不是士的宁[5],经过适当炮制,可以减轻马钱子
毒性,保留药效;麻黄具有“除寒热,破癥坚积聚”之
功效;乳香具有活血、行气、止痛之功,善治气滞血瘀
之痛证;没药具有活血、止痛、消肿之功,与乳香合
用,为宣通脏腑,流通经络之要药,故凡肢体关节诸
疼痛皆能治之,其通气活血之力,又善治风寒湿痹,
周身麻木,四肢不遂,虽为开通之药,不至耗伤气血,
诚良药也。四药合用共奏活血散瘀,消肿止痛之效,
具有明显的抗炎、消肿、镇痛作用[5-7]。
本研究探讨了九分散对实验性类风湿性关节炎
大鼠的影响。实验发现九分散270-540 mg/ (kg·d)能
剂量依赖地抑制CIA大鼠关节肿胀程度,抑制关节滑
膜组织增生,减轻关节的病理改变,改善骨质破坏。
九分散对CIA大鼠关节骨质破坏的改善作用可能与
在早期阻止CIA大鼠关节炎症发展有关,具体机制有
待于进一步研究。
参考文献
[1] 邬国龙.九分散配合雷公藤多甙片治疗类风湿性关节炎60
例[J].中华中医药杂志,2012,27(8):2237-2239
[2] 张月华,伊春锦,陆霞.古方九分散加味治疗痹病的观察与
实验研究[J].福建医药杂志,1994,16(5):34
[3] 张红,王世珍.九分散治痹证验例[J].陕西中医,2001,22(2):
116-117
[4] 王冲山.推荐一个治痹良方“九分散”[J].河南中医,1984,9
(5):49-50
[5] 王姿媛,孙亦群.九分散不同提取部位治疗痹证的药效研
究[J].中国民族民间医药,2009,18(16):3-4
[6] 李淑平,王克美,张昌平.九分散的抗炎镇痛作用研究[J].中
成药,1988,10(8):24-25
[7] 魏世超,徐丽君,张秀桥.马钱子总生物碱对大鼠佐剂性关
节炎的作用[J].中国药理学通报,2001,17(4):479-480
[8] 刘星.中西医治疗类风湿性关节炎研究进展[J].解放军医
药杂志,2012,24(12):52-55
[9] 蔡文虹,孙保东,张宝凤,等.类风湿性关节炎动物模型研究
进展[J].中国当代医药,2012,19(4):10-13
[10] 李培培,解国雄,宋姗姗,等.大鼠佐剂性关节炎模型表现
特征及评价指标[J].中国免疫学杂志,2012,28(5):453-
457
[11] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,
2006:1169
[12] 申作洁,乔玉丹,欧阳胜,等.白桂木抗类风湿性关节炎的
有效部位筛选

扫一扫 手机端浏览

九分散对胶原诱导性关节炎模型大鼠