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熊果酸对 CIA 大鼠关节炎症及骨质破坏的影响

发布时间:2014-06-11 23:15
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一
种以关节滑膜炎、 破坏性关节病变为主要特征的慢
性、进行性、侵袭性自身免疫性疾病,致畸、致残率极
高, 遏制骨质破坏是当前 RA 治疗的难点。 熊果酸
(ursolic acid,UA)是一种天然的三萜类化合物,是多
种中药的主要有效成分,白花蛇舌草、络石藤、藤梨
根、女贞子、五味子等中药均含有熊果酸,研究表明
熊果酸具有抗氧化、抗变态反应、保护肝功能、抗糖
尿病、抗肿瘤等作用,是一种极具开发潜能的天然产
物[1-5]。 熊果酸的抗炎作用成为近年来研究热点。 为
探讨熊果酸对类风湿性关节炎的治疗效果, 本实验
以胶原诱导性关节炎 (collagen-induced arthritis,
CIA)大鼠为模型,观察熊果酸对 CIA 大鼠关节炎症
及骨质破坏的影响。
1 材料与方法
1.1
材料
1.1.1
动物
SPF 级健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠
(购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可
证号:SCXK (湘)2011-0003),8 周龄, ♂, 体质量
(115±21)g,SPF 级实验室正常饲养 1 周后实验。
1.1.2
试剂
牛Ⅱ型胶原(Chondrex);弗氏不完全
佐剂 (Sigma);熊果酸标准品(纯度 98%),Delta 标
准品公司提供;地塞米松注射液:规格 0.5 mL,吉林
精优长白山药业有限公司生产; 甲氨蝶呤片: 规格
2.5 mg,上海信谊药厂有限公司生产。
1.1.3
主要仪器
德国 MicroTec CUT 4060 切片
机;显微镜日产 Olympus vanox 型。
1.2
方法
1.2.1
造模与评估
取 60 只雄性 SD 大鼠。 随机选
取 8 只作为正常对照组, 其余大鼠均复制 CIA 模
型,参考文献[6]进行,将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原
2 mg/mL 与弗氏不完全佐剂(IFA)等体积混合,充分
乳化,制成Ⅱ型胶原乳剂。 大鼠用 10%的水合氯醛
400 mg/kg 麻醉后,在无菌条件下,于大鼠背部及尾
根部多点注射, 每只 0.2 mL 配制好的Ⅱ型胶原乳
剂,以初次免疫当天作为 0 d,第 7 天按上述方法、
相同剂量加强 1 次。 正常对照组按注射等体积的生
理盐水处理。 用关节炎指数(AI)作为判断模型是否
成功的标准[7]。 肢体关节肿胀按 0-Ⅳ级评分:0,无红
肿;Ⅰ,趾关节稍肿;Ⅱ,趾关节及足趾关节肿胀;Ⅲ,
踝关节以下足爪肿胀;Ⅳ,包括踝关节在内的全部足
爪肿胀。 AI 值=四肢肢体关节肿胀级评分之和(Ⅰ级
为 1 分,总分为 16 分)。 AI≥4 分为造模成功,成功
率约为 80%左右。
1.2.2
分组与给药
将造模成功的 CIA 大鼠随机
分为 CIA 模型组、熊果酸组、甲氨喋呤组、地塞米松
组,每组各 8 只。 从初次免疫后 16 d 起,熊果酸组
给予熊果酸 10 mg/(kg·d)灌胃,甲氨蝶呤组给予甲
氨喋呤 0.9 mg/(kg·w)灌胃,地塞米松组给予地塞米
松 1 mg/(kg·3 d)腹腔注射,正常对照组和 CIA 模
型组大鼠分别给予等体积生理盐水灌胃, 于连续给
药 35 d 后每只大鼠四肢行 X 线摄片,再处死动物,
剪下踝关节进行研究。
1.2.3
指标检测
(1)大鼠体质量及关节炎指数测

初次免疫前称质量 1 次, 从致炎后 7 d 起,各
组每隔 7 d,大鼠称质量并用关节评分法评分(0~
Ⅳ级),得出 AI。 (2)足肿胀度评价
自 14 d 起,采
用周长法测量大鼠左后肢足肿胀度[8]。 致炎前测量
每个大鼠左足踝关节周长,从炎症出现后,每隔 7 d
测量 1 次,求出足爪肿胀度(足爪肿胀度=造模后踝
关节周长-造模前周长)。 (3)关节 X 线评分
于连
续给药 35 d 后,即 50 d,各组大鼠四肢关节置于 X
线成像系统(湖南中医药大学附属第一医院放射科)
下摄片, 观察关节骨质破坏程度。 将关节破坏分软
组织肿胀、 骨侵蚀和关节间隙改变 3 个方面进行评
with the model group, the arthritis indices of the groups treated with medications were signifi-
cantly reduced, pathological indices and joint X-ray scores of ursolic acid group were signifi-
cantly reduced (P<0.01) as the same effects as methotrexate and dexamethasone. Conclusion
UA can significantly alleviate the symptoms of CIA rats, control inflammation and reduce joint
pathological changes and bone destruction.
〔Key
words〕
Ursolic
acid;
rheumatoid
arthritis;
collagen -induced
arthritis;
bone destruction
湖南中医药大学学报
2013 年第 33 卷
4
注:与正常对照组比较 **P<0.01;与 CIA 模型组比较△△P<0.01;与熊果酸组比较 #P>0.05。 下表同。
价[7]。 ①软组织肿胀 0 分=正常;1 分=轻微的肿胀;2
分=中度肿胀;3 分=严重肿胀。 ②骨侵蚀评分 0 分=
正常;1 分=可疑或一个微小局部病灶;2 分=两个局
部病灶或病灶总表面积≤50%;3 分=3 个以上的病
灶总表面积>50%;4 分=关节面完全破坏,或出现骨
缩小。 ③关节间隙 0 分=正常;1 分=间隙内出现可
疑或一个微小局部病灶;2 分=关节间隙出现狭窄,
比正常关节间隙减少 25%至 50%;3 分=关节强直或
关节间隙消失。 每只大鼠评价两前足爪和继发侧后
足爪,评分最大值为 9。
1.2.4
踝关节病理切片及观察
处死动物后剪下双
后足炎性踝关节,福尔马林液固定,10%EDTA 脱钙
液中脱钙 21 d,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包
埋,切成 5 μm 切片,脱蜡,进行苏木精-伊红(HE)
染色,封片。 光学显微镜下观察关节病理学改变,进
行病理学评分。 踝关节病理评分为[7]:(1)滑膜细胞
增殖评分:0=无增殖;1=轻微增殖,2-4 层滑膜细胞;
2=中度增殖,4 层以上滑膜细胞;3=滑膜细胞过度增
殖,侵蚀软骨和骨,关节间隙消失。 (2)细胞侵蚀评
分:0=无侵蚀;1=较少的 1 至 2 个细胞侵蚀灶;2=2
至 5 个的局部细胞侵蚀灶;3=5 个以上广泛细胞侵
蚀到关节囊。 (3)血管翳评分:0=无改变;1=两个部
位出现血管翳;2=4 个部位出现血管翳,伴有软骨表
面的侵蚀;3=4 个以上部位出现血管翳或两个部位
出现大范围的血管翳。 (4)炎症评分:0=正常;1=轻
度炎症,出现 1 个聚集物或少量散在炎性细胞(T 细
胞、B 细胞、巨噬细胞及浆细胞)浸润;3=重度炎症,
炎细胞大量侵润,大量白细胞聚集,分散浸润明显。
(5)骨质侵蚀评分:0=正常;1=微量侵蚀,1~2 个小的
浅部位;2=少量侵蚀,1~4 个中等大小和深度部位;
3=中等侵蚀,5 个以上部位, 局部侵蚀到骨皮质;4=
重度侵蚀,多重损伤,局部或完全侵蚀到骨皮质;5=
广泛损伤,皮质穿透骨长度的 25%以上。
1.3
统计学分析
结果以 “x±s” 表示, 组间差异采用 t 检验,由
SPSS 14.0 统计软件进行统计分析,P<0.05 为差异
有统计学意义。
2 结果
2.1
大鼠一般情况观察
实验过程中,正常对照组大鼠状态良好,毛发光
泽,体质量增加。 CIA 大鼠于造模后 14 d 表现出四
肢关节红肿、活动量减少、食欲下降、毛发灰暗无泽
和明显消瘦, 双足关节红肿逐日加重, 足跖明显增
厚,动作迟缓,爬行困难。 各给药组大鼠关节炎症状
较轻,摄食积极,活跃,体质量均持续增加,皮毛光
滑。 甲氨蝶呤组大鼠体质量增长缓慢, 部分大鼠出
现口周溃疡。
2.2
熊果酸对实验性关节炎大鼠 AI 的影响
各组大鼠致炎后 14 d 开始出现多发性关节
炎,AI 升高,21~28 d 左右达到高峰。 与正常对照组
比较,CIA 模型组各时间点 AI 有明显增高,差异有
统计学意义(P<0.01);与 CIA 模型大鼠相比,熊果
酸组、甲氨喋呤组和地塞米松组从 21 d 开始 AI 有
持续的降低,差异具有统计学意义(P<0.01),结果
见表 1。
2.3
熊果酸对 CIA 大鼠足爪肿胀度的影响
CIA 大鼠在免疫后 14 d 开始,每隔 7 d,对各
组大鼠进行左足肿胀部位周长测定 (其与造模前大
鼠左足踝关节周长的差值作为肿胀度),计算左足爪
肿胀度。 与正常对照组比较, 各组造模大鼠足爪肿
胀度明显升高,随着病程延长,肿胀度逐渐升高,免
疫后 48 d,足爪肿胀依然明显。 各给药组大鼠足肿
胀度明显减轻,与 CIA 模型组比较,差异有统计学
意义(P<0.01),结果见表 2。
表 1
熊果酸对 CIA 大鼠不同时间 AI 的影响
(x±s,n=8)


正常对照组
CIA 模型组
熊 果 酸 组
甲氨喋呤组
地塞米松组
剂量(mg/kg)


10
0.9
1
14 d
0.0±0.0
4.2±0.3**
4.3±0.5
4.1±0.4
4.4±0.6
21 d
0.0±0.0
12.5±3.1**
6.4±1.4△△
6.2±1.3△△#
5.9±1.2△△#
28 d
0.0±0.0
13.6±2.8**
6.2±1.8△△
6.1±1.1△△#
5.6±0.7△△#
35 d
0.0±0.0
11.2±3.1**
4.1±0.8△△
4.2±0.8△△#
4.0±0.3△△#
42 d
0.0±0.0
10.1±2.3**
3.1±0.7△△
3.2±0.3△△#
2.9±0.4△△#
48 d
0.0±0.0
8.7±2.1**
2.0±0.3△△
2.1±0.4△△#
1.9±0.3△△#
AI

光,等
熊果酸对 CIA 大鼠关节炎症及骨质破坏的影响
第 7 期
5
图 1
各组大鼠关节的 X 线摄片图
表 2
熊果酸对 CIA 大鼠足爪肿胀度的影响
(x±s,n=8,mm)


正常对照组
CIA 模型组
熊 果 酸 组
甲氨喋呤组
地塞米松组
剂量(mg/kg)


10
0.9
1
14 d
1.1±0.1
16.8±3.6**
15.4±4.6
17.8±3.8
16.9±3.7
21 d
1.2±0.1
27.5±6.4**
10.7±3.1△△
10.4±2.7△△#
9.7±2.4△△#
28 d
1.2±0.2
29.7±8.2**
10.4±2.9△△
10.3±3.1△△#
9.1±1.7△△#
35 d
1.3±0.2
26.4±4.9**
8.6±1.2△△
9.1±2.8△△#
8.5±1.6△△#
42 d
1.6±0.2
25.4±5.2**
8.1±1.8△△
8.7±1.8△△#
7.9±1.7△△#
48 d
2.1±0.3
23.4±3.9**
6.4±1.2△△
6.3±1.3△△#
5.9±1.4△△#
不同时间大鼠足爪肿胀情况
A:正常对照组;B:CIA 模型大鼠组;C:熊果酸组;D:甲氨蝶呤组;E:地塞米松组
表 3
熊果酸对 CIA 大鼠踝关节 X 线评分的影响(x±s,n=8,分)
2.4
熊果酸对 CIA 大鼠关节 X 线片改变及评分的
影响
连续给药 35 d 后,进行大鼠四肢踝关节足爪 X
线摄片,观察骨质破坏情况。 并从软组织肿胀、骨侵
蚀和关节间隙 3 方面进行评分。 影像结果可见 CIA
大鼠踝关节软组织肿胀,骨质疏松、骨密度降低、骨
侵蚀病灶明显可见, 关节间隙狭窄甚至消失。 结果
见图 1。 计算各组大鼠软组织肿胀,骨侵蚀和关节间
隙狭窄评分值进行统计。 与正常对照组比较, 模型
组大鼠关节 X 线评分显著增加(P<0.01),与模型组
比较,各给药组大鼠关节 X 线评分明显降低,差异
有统计学意义(P<0.01),结果见表 3。
表 4 熊果酸对 CIA 大鼠关节切片病理评分的影响(x±s,n=8,分)


正常对照组
CIA 模型组
熊 果 酸 组
甲氨喋呤组
地塞米松组
剂量(mg/kg)


10.0
0.9
1.0
X 线评分
0
7.1±1.3**
2.3±0.5△△
2.5±0.4△△#
2.2±0.6△△#


正常对照组
CIA 模型组
熊 果 酸 组
甲氨喋呤组
地塞米松组
剂量(mg/kg)


10.0
0.9
1.0
病理评分
1.8±0.3
13.2±1.1**
4.1±0.5△△
3.9±0.4△△#
3.8±0.3△△#
A
B
C
D
E
2.5
熊果酸对 CIA 大鼠踝关节病理改变及评分的
影响
如图 2,常规 HE 染色病理切片显微镜检发现,
正常对照组大鼠踝关节间隙正常,关节面光滑,无明
显炎性细胞浸润;CIA 模型组大鼠关节滑膜增生,向
关节腔突出,大量炎性细胞浸润,血管翳形成,软骨
纤维化,关节骨组织破坏;各给药组光镜下病理改变
较模型组明显减轻,滑膜有轻度增生,少量炎性细胞
浸润,关节间隙基本正常。 对病理情况进行评分,与
正常组比较,CIA 模型组关节病理评分明显增多(P<
0.01),与 CIA 模型组比较,各药物治疗组大鼠踝关
节病理评分明显减少(P<0.01),结果见表 4。
3 讨论
RA 最终表现为不可逆的关节侵蚀和破坏。 应
用Ⅱ型胶原蛋白混合(IFA)诱导的胶原诱导性关节
炎模型是研究人类 RA 的理想模型。 该模型能显示
出 RA 的慢性病变特征如关节滑膜增生、 软骨和骨
破坏, 关节功能障碍。 痹肿消汤是梁清华教授在长
期的临床实践中总结出的治疗 RA 有效的方剂,前
期进行了坚实的临床与基础研究[9-11],笔者从痹肿消
汤中筛选出熊果酸等活性成分进行体外实验, 发现
熊果酸体外能明显抑制佛波酯醇 (PMA) 诱导的
湖南中医药大学学报
2013 年第 33 卷
6
图 2
各组大鼠关节改变的病理学光镜图(HE,×100)
A:正常对照组;B:CIA 模型大鼠组;C:熊果酸组;D:甲氨蝶呤组;E:地塞米松组
A
B
C
D
E
BalB/c 小鼠 T 细胞 NF-κB P65 核转移,抑制 T 细胞
表 面 活 化 分 子 CD25、CD69、CD71 的 表 达 ; 抑 制
PMA 加离子霉素诱导的 T 细胞增殖,能减少 T 细胞
分泌白介素-2(IL-2)[12]。 随后的文献报道亦支持了
我们的结果,Checker 等[13]发现熊果酸在体外能抑制
T 细胞、B 细胞、 巨噬细胞的激活与细胞因子分泌,
在移植物抗宿主病小鼠模型中, 熊果酸能通过抑制
淋巴细胞的转录因子 NF-κB、 激活蛋白(activator-
protein,AP)-1 和活化的 T 细胞核因子(NF-AT)来有
效抑制炎症, 减少白介素-6 (IL-6) 和干扰素-γ
(IFN-γ)在血清中的含量。
基于熊果酸的免疫调节作用, 推测熊果酸能够
防治免疫性炎症。 因此, 我们进一步研究了熊果酸
对实验性类风湿性关节炎大鼠的作用, 成功复制了
CIA 大鼠模型,结果显示造模 14 d 后 CIA 大鼠足爪
及踝关节肿胀,活动障碍,发病率高达 80%左右。 熊
果酸给药 10 mg/(kg·d)明显抑制 CIA 大鼠关节肿胀
程度, 抑制关节滑膜组织增生, 减轻关节的病理改
变, 改善骨质破坏, 其效果与地塞米松 1 mg/(kg·
3 d)和甲氨蝶呤 0.9 mg/(kg·w)相当。据本研究结果
及文献报道,推测熊果酸可能是一种高效、低毒的抗
风湿药, 其抑制骨破坏效果可能与熊果酸在早期抑
制 CIA 大鼠关节炎症发展有关,具体机制有待于进
一步研究。
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